犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。近年来，该病对养犬业造成了极大的威胁，严重地影响了我国警（军）犬事业的发展。该病毒在1977年首次由Eugster和Nairn从患腹泻的病犬粪便中分离成功。随后，在世界许多国家陆续报道了该病的流行，并分离出病毒。
自1983年开始，我们对本病进行了一系列的研究。于1986年和1987年分别从同一地区的患犬粪便中分离出两株犬细小病毒，定名为CPV—GN1和CPV—GN2毒株，并对该病毒进行了系统鉴定。现将结果报告如下：
材料和方法
一、主要试剂设备
1、细胞培养粉： MEM（日本产）、BME（美国产）、水解乳蛋白（英国产）。
2、胰蛋白酶：进口分装（美国产）
3、5一溴脱氧尿核苷（瑞典产）。
4、乙醚、氯仿等。
5、96孔微量血凝板、0.O25ml金属稀释棒、96孔细胞培养板、微量振荡器、二氧化碳培养箱等。
6、①毒株：GN1与 GN2毒株为本试验分离鉴定毒株，已传至第 15代。②对照毒株：美国 CPV74一1529毒株（CPV—A，特产研究所提供）；西德 CPV诊断液（血凝素）和猫泛白细胞减少症病毒（FPV），均由长春兽大兽医微生物教研室和南农大传染病教研室提供；貂肠炎病毒（MEV），由长春兽医大学传染病教研室提供。
7、抗血清：①抗GN1毒殊的高免血清，获自按常规免疫的家兔；②德国产抗CPV标准高免血清，由南农大兽医微生物教研室提供；③犬抗 CPV阳性血清（CPV一ch1）和豚鼠抗 CPV阳性血清（CPV一ch2），兔抗MEV阳性血清，均由长春兽医大学研究所病毒室赠送，抗FPV阳性血清，由南农大传染病教研室提供。
8、试验用细胞：CRFK、NLFK、A72细胞系西德引进，由南农大兽医微生物教研室提供。F81由中监所和长春兽医大学传染病教研室提供。MDCK、Vero、MDBK、MA104、BHK、IBRS—2细胞由长春兽医大学传染病教研室提供。
9、试验犬为 6O日龄的断乳犬，经采血样作血凝抑制试验证明，其 HI抗体滴度低于 20倍，并驱虫（口服左旋咪唑）。在攻毒前一周预先测温，采粪样（供作血凝对照）和血样供检。
10、HA缓冲液与细胞单层用 Hauk’s液:0.005M PH7.O PBS，②Hauk’s液。
二、试验方法
（一）、病毒的细胞分离培养
1、粪便标本的制备取患犬的早期粪便，以PBS作1O倍稀释，振荡数分钟以2500转／分离心15分钟，吸取上清9份，加入氯仿1份。振荡混匀后，置4摄氏度感作过夜；再以 300O转／分离心15分种，按每毫升上请加1000单位或微克的青、链霉素，4摄氏度感作两小时后，冻存，以此作为病毒分离的材料。
2、分离病毒 将接种材料按细胞培养量的 1／1O同步接种猫肾传代细胞（ GN1株）或犬肾传代细胞（ GN2株），于3 7摄氏度静置培养，并逐日观察细胞病变（CPE），历时3－5天。培养液为1O％小牛血清，维持液为2％小牛血清，培养过程中的pH值以74％NaHCO3 来校正。
（二）病毒的鉴定
1病毒的血凝（HA）特性
①血凝效价的测定 接改良的Appel等描述的方法进行HA检测。稀释液为PBS；血凝素（抗原）：细胞培养物，经冻融三次；从0.75-l％的猪红细胞悬液为 HA指示细胞。以能使0.5％红细胞凝集的样本最高稀释倍数的倒数为 HA滴度。 ②血细胞凝集谱测定 取能凝集猪红细胞的培养物作为待测样品，按表2所示方法在同样条件下与恒河猴、猪、猫、马、牛、绵羊、山羊、犬、家兔、豚鼠、地鼠、小白鼠、鸡、鹅、人一O型的0.5％红细胞进行HA试验，观察病毒液对不同种类动物红细胞的凝集特性。
2、病毒的细胞敏感谱试验
本试验选择猫肾传代细胞系（CRFK、NLFK、F8l）、犬肾传代细胞系（MDCK）、犬纤维瘤细胞系（A72）、猪肾传代细胞系（IBRS）、地鼠肾细胞系（BHK）、绿猴肾细胞系（Vero）、罗猴肾细胞系（MA104）、牛肾细胞系（MDBK）等多种细胞作为接种对象，分别接种已适应在猫肾细胞上HA滴度≥128x的第15代细胞培养液（冻融三次）。按常规方法进行同步或单层吸附接毒，37℃静置培养24小时后，换维持液（单层接毒不换液），逐日观察CPE，4－5天收获冻融，再以同样方法连传3—5代，以出现CPE和HA作为感染指标。
3、病毒的理化学特性鉴定
按Hitoshi等和殷震等描述的方法进行。以5一溴脱氧尿核苷（BUDR）代谢抑制试验检查两分离毒株的核酸型，以常规方法检查病毒对2O％乙醚和5％氯仿的敏感性，对0.5％胰蛋白酶的耐受力，以及病毒的抗酸（PH3.0）能力和耐热（56℃30分钟、80℃10－120分钟）能力。
4、病毒的形态学观察
将猫肾传代细胞培养物快速冻融三次，300O转／分离心20分钟，除去细胞碎片，取上清以2％磷钨酸盐进行负染，在J－2型电镜下进行病毒形态观察。利用含毒上清液与等量的CPV阳性高免血清混合，于37℃感作60分钟，最后用电镜载物铜网沾取病毒一血清复合物负染，在电镜下观测桥联作用。
5、病毒的交叉血凝抑制试验。
本试验在V型血凝板上进行。以稀释棒法取不同来源的血清作横排2×系列稀释。每一血清稀释两横列，一横列加 4－8单位抗原，一横列加PBS。充分振荡后, 37℃后感作一小时，最后每孔加入两滴（0.025ml／滴）PBS配制的猪红细胞悬液。充分振荡混匀后，干4℃感作2－4小时。在对照成立的情况下，以本应出现凝集组但被完全抑制的最高血清稀释度的倒数来作为HI的判定。
6、病毒交叉中和试验。
当F81在96孔细胞微量培养板上长成近7O％的单层后，取各自以4×连续横行排列稀释的免抗CPV－GNl高免血清，犬抗CPV一ch1免疫血清和豚鼠抗CPV一ch2免疫血清，统一加入等量200个TCID50的CPV一GNl培养物，37℃感作一小时后，在微量板上进行中和试验。同时设血清、病毒与健康细胞对照，于5％ CO2(37℃）培养箱中培养 5—7天，每天观察细胞病变和收毒测 HA滴度，其结果按Reed—Muench氏法计算其中和效价。
7、GN病毒株动物复归试验选择8头2月龄左右的健康幼犬，攻毒前先对其进行体温、白细胞总数、粪便HA滴度、血清中抗CPV的HI抗体水平等检查。攻毒时随机将其分为两组，一组2头，口服G N1株病毒培养液 4ml／头；另一组 6头经口接种 GN2株 8ml／头（均为15代细胞适应毒）。接种后，逐日测温以及采粪样作HA试验，于接种后的第 3和第 7天，分别采血样作白细胞计数，于接种后的第 7和第 14天分别采血样测HI效价。每组第5天分别捕杀1头犬，并对自然、人工致死的试验犬分别收集脾、心、肝、肺、肾、小肠、肠系膜淋巴结等器官的样品，置低温保存，按常规病毒分离方法处理病料，接种F81细胞上，以观察回收样品能否出现CPE现象和HA活性。
结果
（一）病毒的分离
1、 CPV—GN1株先在 F81细胞上适应二代，第一代接毒细胞无明显细胞病变，但HA效价（ 64×左右）。从第二代开始，约在接种后24—26小时出现明显的细胞病变，以细胞圆缩，胞浆收缩或聚集成网状为其主要特征，以后病变细胞呈葡萄串脱落。取其二代培养物快速冻融三次后转入CRFK细胞上进行第三代培养。
2、CPV—GN2株先在犬肾细胞上适应一代，接种细胞虽无明显CPE，但HA则为128×，第二代接种猫肾传代细胞（CRFK）在CRFK细胞上连传三代后即出现明显的细胞病变,其HA达128×以上。
3、血凝范围测定在4℃反应条件下,PBS的PH在6.0－7.4范围内，CPV一GN1株能很好地凝集猪和恒河猴红细胞，也能凝集马和猫的红细胞，而不能凝集其它动物的红细胞。在 22℃、 37℃环境中，其HA敏感性降低，在2－3小时后病毒可以RBC上解脱下来。经比较，FPV的HA活性对温度要求比较严格，其温度仅限于4℃，PH值限于6.0一6.4范围，凝集红细胞的能力以猪、恒河猴及马的红细胞最明显，不能凝集猫等其它动物的红细胞。
（二）病毒对不同细胞的敏感（细胞感染谱）试验
本试验将 GN1和 GN2两株病毒分别在1O种细胞上同步连续培养 5代，并逐代观测 CPE与HA活性。结果表明，两株毒均可在三种猫肾传代细胞（CRFK、F81、NLFK）上增殖，也可在犬纤维瘤细胞系（A72）上增殖。在MDCK细胞上，同步接种连传5代或单层吸附接种连传3代，均未发现明显的病毒增殖现象。两毒株MDCK、MA104、Vero、IBRS、BHK等细胞上既无CPE，其培养液亦无HA活性。
（三）病毒的理化学特性
两分离毒株的理化学特性试验结果表明，BUDR能抑制GN1和GN2毒株的增殖，证明分离毒的核酸是DNA型。两毒株都能抵抗20％乙醚4℃24小时、5％氯仿4℃1O分钟、PH3．0 37℃2小时和0.5％胰蛋白37℃1小时处理。也能抵抗56℃30分钟、80℃1O分钟的高温处理；80℃10—3O分钟病毒部分失活，80℃6O分钟内病毒全部失活。
（四）病毒的形态观察结果
将病毒悬液敷子铜网上，经2％磷钨酸负染镜检，在1个视野见有散在的病毒颗粒。在此基础上又进行了免疫电镜观察（即在病毒液中加等量的抗 CPV免疫血清,37℃ 6 O分钟后将样品沾于铜网上，磷钨酸负染），在电镜下均可．见到凝集成团的桥联现象，病毒颗粒大小均一。病毒颗粒有电子密度相差悬殊的空心和实心两种形态存在。多为圆形，无囊膜，直径约20－22毫微米。
（五）病毒的单相交叉中和试验
用已知的犬抗 CPV－Chl（长春株）和豚鼠抗 CPV— Ch2株，以及免抗 CPV— GN1株的血清与 100个TCID50的 CPV－ GNl进行单相交叉中和试验。结果按 Reed－Muench氏法计算表明，三种血清都能与 CPV－ GNl株病毒产生中和反应；中和效价均为1:256。
（六）病毒的交叉血凝抑制试验
用已知的cpv抗血清（抗cpv－G西德株、犬抗cpv－CN和豚鼠抗cpv—Ch2），同时对GN和GN2（4一8单位）分离毒株进行 HI试验。并以免抗 CPV－GNl株免疫血清与美国标准毒株（CPV－A）做交叉血凝抑制试验。为比较分离毒株与 FPV、MEV抗原关系，试验中还将分离毒与抗 FPV血清、抗 MEV血清进行交叉 HI试验。结果表明：CPV—GN1株与本源抗血清 HI效价为 1280×，同源美国、西德标准毒株和国内毒株的HI效价为640—1280×，相差1个滴度以内。而与异源毒株（FPV、MEV）交叉HI效价为80－320×，相差4个滴度以上。
（七）病毒的动物回归试验
以GN1口服接种2头小犬，GN2口服接种6头小犬，试验接毒后的临床观察以及粪便、血清、白细胞检测结果详见表6。结果表明：两毒株在接种后2一7天，试验犬陆续表现短暂的温和型临床症状。接种后第2天有1头犬出现严重的呕吐，大便带血，体温升高（40.3℃），食欲废绝，精神沉郁，在接种后第3天死亡。病理解剖发现小肠出血，粘膜脱落，肠系膜淋巴结肿胀、出血；肠腔内有血样粪便。两毒株接毒后 3天， 4／7的犬白细胞减少且临床症状基本消失, 2—14天，粪便中均有病毒排出。接种后7天,HI效价平均为 320×；到第 14天升达 64O－1280×。
于接种后5天，取自然死亡犬和捕杀抽验的两头犬（每组1头）的脾、肾、肠系膜淋巴结、小肠等脏器，研磨制成10×乳悬液，冻融数次后离心，取上清接种F81细胞，均成功地分离到病毒。在接种后的2—5天收集的粪便中也分离出病毒。
讨论
一、关于GN病毒株的一般性状
本课题从患出血性肠炎病犬粪便中分得CPV一GNl和CPV－GN2两毒株，经生物学特性和理化特性鉴定，与国内外描述的CPV基本一致。证实我们分离的两株病毒属于小DNA病毒科、细小病毒属的成员之一。
关于CPV对MDCK细胞的敏感性,Siegl和Maehgub的研究认为，各种MDCK细胞株对CPV的感染性有一定差异。据报道，有的毒株在某些MDCK细胞株上（C株）呈钝感甚至不增殖。本试验发现，病毒在MDCK细胞上，无论是同步接种速传5代或单层接种连传三代，均未见有病毒的增殖和细胞病变。对此我们分析有以下几种可能；①所用的MDCK细胞株对CPV缺乏易感性；②病毒在MDCK细胞上的传代代次偏低；③分离毒株在培养和细胞适应过程中交叉培养史不同。从实验程序来看，我们分离的毒株因在猫肾细胞上已适应15代，待转到MDCK细胞上，初始几代培养中暂不适应；④病毒毒株间的差异，如同Eugstev（1980）、Appel （1979）等报道的CPV对Vero细胞敏感性不一样，GN病毒本身就对MDCK细胞缺乏易感性。上述推测，尚待进一步研究证实。
二、分离毒株与已知毒株，以及FPV、NEV之间的血清学关系
在本试验中，交叉血凝抑制试验的结果表明，两分离毒株均能与 FPV、MEV产生交叉 HI反应，但 3种病毒的抗血清与同源病毒反应测得的HI效价，比与异源病毒反应测得的HI效价，高4个滴度以上，这些结果不仅证明两分离每株与其他学者报道的CPV结果一致，与FPV、MEV有相关的抗原性；而且也说明3种病毒抗原与抗体的亲和性以同源为高；这种亲和性与制备抗体的动物种类可能无关。
三、关于细小病毒的致病性
许多学者认为:CPV人工感染犬只引起温和型临床变化。在本试验中，以两株分离病毒人工感染8头犬后，仅有1头在接种后2天出现典型的临床症状，并于第3天死亡。其它7头犬仅表现短暂的温和型症状，且于第7天恢复正常。从自然死亡犬和在第5天捕杀犬的脏器中，以及从接种病毒后第2－5天的粪便中，均回收到了细小病毒。以上结果与国外报道相似。与此相比较，以病料（自然感染犬的脏器和粪便提取物）回归动物，可导致与自然感染相类似的临床症状。故在一些CPV疫苗效力试验中，多使用自然病犬含毒脏器悬液作为试验动物的攻毒材料。
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发表于 2006-2-14 14:54
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发表于 2006-11-16 13:44
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